【耀文解读】Nature子刊|吸入式外泌体递送IL-12 mRNA治疗肺癌的最新研究
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2024-2-7

肺癌是最常见的癌症,也是世界上存活率最低的癌症之一

IL-12等细胞因子已显示出作为肿瘤抑制因子的巨大潜力。然而,由于脱靶毒性,它们的应用受到限制。这一研究方向不仅是当前癌症领域的一个重要前沿课题,也是一个迫切需要解决的问题。

最近,自然杂志子刊Nature Nanotechnology【IF: 38.3】发表了哥伦比亚大学程柯教授团队的相关研究论文《Inhalable extracellular vesicle delivery of IL-12 mRNA to treat lung cancer and promote systemic immunity》。

在这项研究中,作者开发了负载IL-12 mRNA的可吸入外泌体(一种细胞外囊泡),基于外泌体实现鼠源白介素12(IL-12)的小鼠体内递送,以解决肺癌问题并增强肺肿瘤小鼠模型的全身免疫力。IL-12 mRNA通过电穿孔加载到人胚胎肾细胞来源的外泌体(HEK-Exo)中,产生负载IL-12 mRNA的外泌体(IL-12-Exo)。在肺肿瘤小鼠吸入时,IL-12-Exo在免疫抑制性肿瘤微环境(TME)生物分布中优于脂质体包封的IL-12 mRNA(IL-12-Lipo),并将全身毒性降至最低。吸入式 IL-12-Exo 促进了 IFNγ 介导的免疫激活、全身免疫和免疫记忆,最终抑制了肺肿瘤并增强了对肿瘤再造的抵抗力。

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一、IL-12-Exo的制备与优越的肺分布

现有研究证明,IL-12的表达升高与癌症患者生存结果增强之间呈正相关,IL-12在抗肿瘤治疗中具有有利的调节作用。作者选用极低免疫原性的HEK-Exo作为mRNA递送平台,制备了IL-12 mRNA并使用电穿孔技术开发了IL-12-Exo。同时,将IL-12-Lipo作为对照进行分析(左图1 a)。两种配方均显示负表面电荷和相似的包封效率水平和纳米级分布(左图1b)。与IL-12相关的全身毒性仍然是其在癌症治疗中应用的主要障碍,血清 IL-12 浓度升高会导致静脉注射荷瘤小鼠的肝毒性和体重减轻。实验评估了吸入IL-12-Exo对肺TME的靶向能力,体外成像结果显示在吸入24h后IL-12-Exo明显偏爱于肺富集,并成功递送至肿瘤细胞中(左图1d)。流式细胞结果则显示,与IL-12-Lipo相比,IL-12-Exo的摄取率更高,尤其是在LL/2肿瘤细胞这一内化的原代细胞中(左图1g)。

图1 IL-12-Exo的体外表征、肺分布与刺激肺表达IL-12

二、IL-12-Exo在肺部TME中稳定表达 IL-12

接着作者在IL-12-Exo的主要靶标 LL/2 肿瘤细胞中探索了IL-12的表达。转染IL-12-Exo的LL/2细胞显示出显著的IL-12水平,而PBS或游离HEK-Exo处理的细胞因子存在不显著(右图1b)。同时,IL-12-Exo 给药引发了至少 3 天的稳健、持续的 IL-12 表达,优于 IL-12-Lipo(右图1c),相比之下后者则显示IL-12在血液、肝脏和肾脏中迅速扩散,同时血清天冬氨酸转氨酶(AST)水平升高(右图1e-g)。IL-12给药3天后,肺TME内的免疫刺激显示 IL-12-Exo 的 CD8+ T 细胞比 IL-12-Lipo 的增加,并伴有 CD4+ T 细胞、NK细胞和单核细胞的募集增加 (右图1j)。这些结果强调了IL-12-Exo在TME中促进局部IL-12表达的能力,从而避免了脱靶毒性并提高了全身细胞因子的耐受性。

三、IL-12-Exo有效延缓肿瘤生长

在确认 IL-12 在肺 TME 中的优先驻留和持续保留后,文章继续评估了 IL-12-Exo 在 LL/2 同型移植肺肿瘤模型中的抗肿瘤能力。IL-12-Exo显著抑制了肺部肿瘤的生长,表现出优异的抗肿瘤功效,与IL-12-Lipo组的明显体重减轻形成鲜明对比,同时肺重量相应降低(左图2c-2d)。在生存率方面,IL-12-Exo组的死亡时间延迟发生在肿瘤攻击后30~50 d,而IL-12-Lipo在30~50 d之间发病,空白对照PBS治疗的小鼠则最早死亡(左图2g-2i)。对于转移性肿瘤,作者建立了 B16F10 细胞诱导的肺转移性黑色素瘤模型。与IL-12-Lipo相比,IL-12-Exo显著抑制肿瘤进展,体重适度增加,同时减少肺重量和转移位点。此外,IL-12-Exo减轻了B16F10 肿瘤感染肺中酪氨酸酶相关蛋白 1 (Tyrp1)的相关mRNA 表达,其治疗的小鼠寿命均更长(左图2k)。
图2 IL-12-Exo延缓原位肺肿瘤的生长、IL-12-Exo诱导的IFNγ驱动TME调节

四、IL-12-Exo诱导的IFNγ驱动TME调节

已知IL-12主要通过IFNγ激活先天性和适应性免疫区室内的细胞,在治疗中发挥关键作用。作者发现在IL-12-Exo 给药1d后IFNγ 迅速上调,并维持高水平直到第 3 天,且超过了IL-12-Lipo(右图2a)。具体而言,IL-12-Exo和IL-12-Lipo处理均显著增加了CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、NK细胞和NKT细胞群,同时降低了免疫抑制调节性T细胞和髓源性抑制细胞(MDSC)(右图2c-2d)。治疗后TME的变化包括M1样巨噬细胞的增加和M2样巨噬细胞的减少。对 B16F10 肺转移性 TME 免疫变化的进一步分析显示,IL-12-Exo 处理后CD8+ T 细胞、CD4+ T细胞和 NKT 细胞的浸润增强,极大地推动了病灶转化为“热”肿瘤。总的来说,IL-12-Exo疗法彻底重塑了TME,有利于细胞毒性T细胞而不是耗竭的T细胞。此外,IL-12 mRNA治疗还引发了TME中广谱炎性细胞因子和趋化因子的上调。即使在肿瘤接种后 30 天,高 IFNγ 水平仍持续存在。

五、IL-12-Exo疗法对T细胞的影响

在确定IFNγ的关键作用后,文章深入研究了在 LL/2 肿瘤接种后 30 d对 IL-12-Exo 治疗响应驱动 IFNγ 表达的原代细胞类型。其中,以CD8+ T和NKT细胞最为显著,又以CD8+T细胞为主要效应子(左图3a-3c)。同时,IL-12-Exo在治疗后相当长的时间里,保持了有效的CD8+ 、CD4+ 记忆 T 细胞以及NK、NKT记忆细胞的增长,为再次的发生肿瘤提供了抵抗力(左图3g-3f)。具体为,接种过IL-12-Exo的小鼠再次暴露于肿瘤环境中时,表现出21天的肿瘤迟缓生长,与对照组形成鲜明对比(左图3h)。同时,根据实验结果,CD8+T 细胞反应的诱导主要由交叉呈递的 1cDCs 细胞驱动。IL-12-Exo 疗法促进了 DC 迁移和随后在淋巴结中的交叉呈现,从而启动了全身性抗肿瘤 T 细胞反应,这对于持久的肿瘤抑制至关重要(右图3e-3h)。

图3 CD8+ T细胞对IL-12-Exo介导抗肿瘤的重要作用及治疗后的全身性 T 细胞保护
最后,为评估IL-12-Exo的长期毒性和安全性,文章进行了一项三剂量递增的临床前试验。小鼠表现出相似的体重百分比变化,表明IL-12-Exo不会导致体重快速减轻。且各组之间标准化组织重量没有明显差异,原发器官均无严重病变,长期临床前毒性数据包证实了IL-12-Exo具有良好的安全性。

六、小结

文章报告了一种基于使用外泌体递送 IL-12 mRNA的可吸入治疗性癌症疗法 IL-12-Exo,实现了直接局部递送到肺部 TME。在同基因小鼠肺肿瘤模型中,IL-12-Exo 在为期 6 周的研究中实现了局部和全身抗肿瘤免疫反应,减少了“细胞因子风暴”而没有检测到毒性。具体为吸入 IL-12-Exo 后,IL-12 表达刺激增强了CD8+ T 细胞产生IFNγ。IL-12-Exo 还促进记忆免疫细胞增殖,使肿瘤在再次攻击时产生排斥反应。但研究也有一定的局限性,如电穿孔技术成本高昂,吸入方式可能不适合有呼吸系统并发症的患者。
总之,IL-12-Exo 是一种有效的 IL-12 mRNA 递送系统,可有效治疗原发性肿瘤和转移瘤。与脂质体对照相比,外泌体可促进 IL-12 表达并减轻毒性。作为一种非侵入性方法,吸入保证了优于瘤内注射的患者依从性。外泌体作为生物相容性囊泡,可提供多功能的RNA递送解决方案。因此,文章提出了一种基于外泌体系统的前瞻性肿瘤治疗方案,阐明了其广泛的治疗潜力,拓宽了mRNA的临床应用范围。
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