细胞质膜上的磷脂分子分布具备不对称性质：磷脂酰丝氨酸（PS）位于膜的内层，而磷脂酰胆碱（PC）位于膜的外层。然而，这种不对称在某些生理情况下会被破坏从而导致自身免疫性疾病。在这些过程中，一种叫做超燃酶的蛋白质会被激活，这种蛋白质可以双向和非特异性地运输脂质。然而，几十年来，这些酶的分子机制仍然未知。

之前研究确定了钙依赖性超燃酶TMEM16F及其家族成员和半胱天冬酶依赖性脂质混乱蛋白Xkr8及其家族成员是脂质混乱的主要参与者。其中，Xkr8、Xkr4和Xkr9是通过半胱天冬酶介导的C端切割到细胞质区而被激活的。为了阐明Xkr4激活的机制，日本京都大学的科学家进行了三种筛选实验：cDNA文库筛选、基于质谱的蛋白质相互作用筛选以及新开发的利用CRISPR-Cas9 sgRNA文库的无偏筛选系统以阐明细胞膜上磷脂分子的混乱与流动机制。

基于三种筛选实验的结合，结果表明：通过cDNA文库筛选分离出具有组成活性的Xkr4突变体，同时对Xkr4突变体进一步的鉴定表明，Xkr4通过二聚体化和结构变化两个步骤被激活的，同时，蛋白相互作用筛选表明XRCC4片段与Xkr4二聚体结合，使用CRISPR sgRNA文库筛选鉴定出XRCC4为xkr4激活因子，半胱天冬酶介导的XRCC4片段的位置变化对于调节Xkr4在质膜上的活性至关重要。为了研究XRCC4片段暴露的PS是否作为吞噬细胞识别凋亡细胞的“吃我”信号，作者将巯基乙酸酯诱导的巨噬细胞与紫外线照射诱导的凋亡细胞一起混合培养。通过Staurosporine（STS）、Fas配体（Fasl）、紫外线照射、γ辐照对细胞的凋亡刺激，结果显示，多种凋亡刺激综合产生的XRCC4片段参与促进了脂质混乱。为了确定XRCC4的哪些区域需要对Xkr4进行调控，作者构建了一系列缺失突变体，最后证实了XRCC4的C端片段释放到细胞质中调控Xkr4。然后，电转染结果表明，C20合成肽与荧光四甲基罗丹明偶联体(C20-TMR)保留在表达xkr4dc细胞的质膜上，而不保留在表达xkr4fl的细胞上。这些结果有力地表明，核蛋白XRCC4的半胱天冬酶切割片段通过与细胞死亡过程中质膜上的脂质混乱直接相关来激活Xkr4二聚体。

简而言之，本研究发现核蛋白XRCC4的半胱天冬酶片段可作为质膜重组酶Xkr4的激活剂。在细胞凋亡刺激下，XRCC4被半胱天冬酶切割，其C端片段被释放到细胞质中，直接与Xkr4二聚体相互作用以激活二聚体，调节与刺激细胞质膜上的磷脂双分子层的混乱与流动（图1），导致膜内层磷脂分子外翻从而向吞噬细胞发出“吃我”的信号。

图1 XRCC4片段从细胞核释放激活Xkr4

本研究中，作者使用NEPA21（NEPA GENE）电转染仪将Fas表达载体电穿孔到Cos-7细胞中，产生亮氨酸片段标记的Fas配体（FasL），进而进行Fasl刺激细胞凋亡实验。在CRISPR-Cas9 sgRNA文库筛选过程中，作者使用NEPA Porator（NEPA GENE）双波高效电转染仪在2700V电压脉冲条件下将质粒电转染到大肠杆菌DH10B中以生产慢病毒，通过病毒感染细胞，细胞基因组DNA中受感染的慢病毒sgRNA被激活，生成一个富集的sgRNA文库，用于下一轮筛选。作者质疑Xkr4是XRCC4细胞质中的片段存在下是如何被激活的。为了研究这一点，将SPOT和FLAG标签分别融合到Xkr4DC的N端和C端，为了在完整细胞中证实这种相互作用，将C20合成肽与荧光四甲基罗丹明（C20-TMR）偶联，并采用ELEPO21（NEPA GENE）体外高效电转染仪搭配贴壁电极电穿孔到HCT116细胞表达Xkr4FL-GFP或Xkr4DC-GFP。电穿孔后，C20-TMR保留在表达xkr4dc细胞的质膜上，而不保留在表达xkr4fl的细胞上。该结果有力地表明，核蛋白XRCC4的切割片段通过与细胞死亡过程中质膜上的脂质混乱直接相关来激活Xkr4二聚体。

本实验使用了不表达凋亡的Xkr家族成员的PLB细胞。在PLB细胞中重组Xkr4，并在其他Xkr家族成员缺失的情况下分析其功能。从而明确了Xkr4的激活机制。但在表达Xkr8的正常细胞中，凋亡刺激后Xkr4对脂质乱序的影响没有那么强。因此，这项研究提出了一个重要的问题，即Xkr4是否仅在细胞死亡的情况下被激活？还有待考究。

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原文链接：10.1016/j.molcel.2021.02.025

参考文献：Maruoka M, Zhang P, Mori H, Imanishi E, Packwood DM, Harada H, Kosako H, Suzuki J. Caspase cleavage releases a nuclear protein fragment that stimulates phospholipid scrambling at the plasma membrane. Mol Cell. 2021 Apr 1;81(7):1397-1410.e9. doi: 10.1016/j.molcel.2021.02.025. Epub 2021 Mar 15. PMID: 33725486.

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